Nowe badania mogą doprowadzić do drukarki 3D DNA

"Jeśli jesteś inżynierem mechanikiem, naprawdę fajnie jest mieć w swoim sklepie drukarkę 3D, która może wydrukować część z dnia na dzień, więc możesz przetestować ją następnego ranka" - powiedział Dan Arlow, absolwent UC Berkeley. "Jeśli jesteś badaczem lub bioinżynierem i masz instrument, który usprawnia syntezę DNA," drukarkę DNA ", możesz szybciej przetestować swoje pomysły i wypróbować nowe pomysły. Myślę, że doprowadzi to do wielu innowacji. "

Badania poprowadził Arlow i doktorant Sebastian Palluk, doktorant na Technische Universität Darmstadt w Niemczech i zaproszony student w Berkeley Lab. Jest on opublikowany w artykule zatytułowanym "Synteza DNA de novo za pomocą koniugatów polimerazy-nukleotydu", do której można uzyskać dostęp. Badania zostały przeprowadzone w Joint BioEnergy Institute (JBEI) Departamentu Energii.

"Osobiście uważam, że nowa metoda Dana i Sebastiana mogłaby zrewolucjonizować sposób, w jaki tworzymy DNA" - powiedział Jay Keasling, profesor chemii UC w Berkeley. i inżynieria biomolekularna, starszy naukowiec wydziału w Berkeley Lab i dyrektor generalny JBEI

Specjaliści Keasling i JBEI specjalizują się w dodawaniu genów do drobnoustrojów, zazwyczaj drożdży i bakterii, aby w zrównoważony sposób wytwarzać użyteczne produkty. Palluk pochodził z Niemiec specjalnie po to, by pracować z Arlowem w laboratorium Keaslinga.

"Wierzymy, że zwiększony dostęp do konstruktów DNA przyspieszy rozwój nowych leków na choroby i uprości produkcję nowych leków" - powiedział Palluk .

Synteza DNA to rozwijająca się firma; firmy zamawiają geny na zamówienie, aby mogły produkować chemikalia, leki biologiczne lub enzymy przemysłowe. Naukowcy kupują syntetyczne geny, aby zaprojektować rośliny i zwierzęta lub wypróbować nowe terapie oparte na CRISPR. Niektórzy naukowcy badali nawet przechowywanie informacji w DNA, ale wymagałoby to znacznie większych ilości DNA niż obecnie syntetyzowane. Wszystkie te zastosowania wymagają, aby synteza wytworzyła pożądaną sekwencję nukleotydów lub zasad, bloków DNA w każdej z milionów lub miliardów kopii cząsteczek DNA.

Obecna synteza DNA ogranicza się do produkcji oligonukleotydów Długość 200 zasad, ponieważ błędy w procesie powodują niską wydajność poprawnych sekwencji wraz ze wzrostem długości. Aby złożyć nawet niewielki gen, naukowcy muszą połączyć odcinki o długości około 200 zasad. Czas realizacji dla małego genu o długości 1500 zasad może być krótkidwa tygodnie za 300 USD, co ogranicza eksperymenty, które naukowcy mogą zrobić. Syntetyczni biolodzy, tacy jak Arlow, Palluk i Keasling, często umieszczają od razu w jednym tuzinie różnych genów, aby uzyskać produkcję chemiczną, a każdy gen przedstawia własne problemy syntezy.

"Jako student w Niemczech, Byłem częścią międzynarodowego konkursu syntetycznej biologii, iGEM, w którym staraliśmy się zmusić bakterie E. coli do degradacji plastikowych odpadów "- powiedział Palluk. "Wkrótce zdałem sobie jednak sprawę, że większość czasu poświęconego na naukę poświęcono po prostu zebraniu całego DNA, nie przeprowadzaniu eksperymentów, aby sprawdzić, czy skonstruowane komórki mogą rozbić plastik. To naprawdę zmotywowało mnie do przyjrzenia się procesowi syntezy DNA. "

Technologia opracowana przez Palluka, Arlowa, Keaslinga i ich zespół opiera się na enzymie syntetyzującym DNA znajdującym się w komórkach układu odpornościowego, który ma naturalną strukturę. zdolność do dodawania nukleotydów do istniejącej cząsteczki DNA w wodzie, gdzie DNA jest najbardziej stabilny. Technologia powoduje zwiększoną precyzję, umożliwiając syntezę nici DNA o długości kilku tysięcy zasad - średniej wielkości gen.

"Wymyśliliśmy nowy sposób syntezy DNA, który wykorzystuje maszynerię, którą sama natura wykorzystuje do tworzenia DNA ", powiedział Palluk. "To podejście jest obiecujące, ponieważ enzymy ewoluowały przez miliony lat, aby przeprowadzić tę dokładną chemię."

Komórki tworzą DNA poprzez jego kopiowanie za pomocą kilku różnych enzymów polimerazy, które budują DNA już w komórce. Jednak w latach sześćdziesiątych naukowcy odkryli polimerazę, która nie opiera się na istniejącym szablonie DNA, ale zamiast tego losowo dodaje nukleotydy do genów wytwarzających przeciwciała dla układu odpornościowego. Enzym, zwany terminalną transferazą dezoksynukleotydylową (TdT), tworzy losową zmienność w tych genach, dając w rezultacie białka przeciwciał, które są lepiej zdolne do atakowania nowych typów najeźdźców.

TdT jest szybki i nie ma reakcji ubocznych które mogłyby wpłynąć na powstałą cząsteczkę. Naukowcy przez lata próbowali użyć tego enzymu do syntezy sekwencji DNA, ale trudno było to kontrolować. Kluczem jest znalezienie sposobu na dodanie enzymu do jednego nukleotydu, a następnie zatrzymanie go, aby sekwencja mogła być syntetyzowana jedną zasadą na raz. Poprzednie podejścia próbowały uzyskać tę kontrolę za pomocą zmodyfikowanych nukleotydów ze specjalną grupą blokującą, która zapobiega jednoczesnemu wielokrotnemu dodawaniu. Po rozszerzeniu cząsteczek DNA przez zablokowany nukleotyd, grupy blokujące są usuwane, aby umożliwić następnedodatek.

TdT nie może jednak przyjąć grupy blokującej dodawanego nukleotydu. Ale Arlow wpadł na pomysł, aby unieruchomić niezablokowany nukleotyd na TdT, tak aby po dodaniu nukleotydu enzym pozostał przyłączony i zapobiegał dalszym dodatkom. Po rozszerzeniu molekuły odcina się linkę, uwalniając enzym i ponownie eksponując koniec następnego dodania.

W pierwszych próbach naukowcy wykazali, że ta technika jest nie tylko szybsza i prostsza. , ale prawie tak dokładne, jak inne techniki na każdym etapie syntezy.

"Gdy analizowaliśmy produkty za pomocą NGS, byliśmy w stanie stwierdzić, że około 80 procent cząsteczek miało pożądaną sekwencję o 10 zasadach - powiedział Arlow. "Oznacza to, że średnia wydajność każdego kroku wynosiła około 98 procent, co nie jest złe na pierwszy rzut w tym 50-plus-letnim problem. Chcemy osiągnąć 99,9%, aby uzyskać DNA o długości genów. "

Po osiągnięciu 99,9% wierności, mogą zsyntetyzować cząsteczkę o długości 1000 zasad z wydajnością ponad 35% , co jest obecnie niemożliwe przy istniejących technikach.

"Poprzez bezpośrednie syntezowanie dłuższych cząsteczek DNA, potrzeba połączenia oligonukleotydów razem i ograniczenia wynikające z tego żmudnego procesu mogą zostać zredukowane" - powiedział Palluk. "Naszym marzeniem jest bezpośrednia synteza sekwencji długości genów i dostarczenie ich do naukowców w ciągu kilku dni." Mamy nadzieję, że technologia ułatwi bioengineerom szybsze zrozumienie, w jaki sposób można wykorzystać biomanię produkty, które mogłyby prowadzić do bardziej zrównoważonych procesów wytwarzania rzeczy, od których wszyscy na całym świecie polegamy, w tym odzieży, paliwa i żywności, w sposób, który wymaga mniejszej ilości ropy naftowej ", powiedział Arlow.

On dodał , "Naszym marzeniem jest stworzenie genu z dnia na dzień. Dla firm próbujących w zrównoważony sposób produkować biopaliwa użyteczne produkty, nowe farmaceutyki lub narzędzia dla rolnictwa bardziej przyjaznego dla środowiska, oraz dla JBEI i DOE, gdzie staramy się wytwarzać paliwa i chemikalia z biomasy, synteza DNA jest kluczowym krokiem. Jeśli przyspieszysz, może to radykalnie przyspieszyć cały proces odkrywania. "